在实验室环境中，细胞的培养根据其类型主要可以分为三大类：贴壁细胞、悬浮细胞和半贴壁细胞。贴壁细胞通常会粘附在培养容器上，悬浮细胞则在生长培养基中漂浮而不附着。半贴壁细胞则呈现出不完全黏附的状态，一部分细胞会附着在容器中，而另一部分可能悬浮在培养基中。

此外，细胞也可依其生长特性进一步分类为有限增殖和无限增殖。有限增殖细胞通常只能够维持有限的生长能力，经典的例子是从组织中提取的原代细胞或经过一定代数后停止增殖的细胞系。相对而言，无限增殖的细胞具有持续分裂的能力，通常是通过转化获得的，表现出类似癌症的特征，如失去接触抑制。

在本文中，我们将主要聚焦于贴壁细胞和悬浮细胞这两种常见细胞类型。需要特别注意的是，进行细胞培养的所有操作都必须遵循严格的无菌技术和适当的控制措施。

第一阶段 冷冻保存

由于遗传不稳定性的积累，持续培养的细胞需要在收到细胞系后尽快进行冷冻保存。这一操作能够确保细胞库的遗传特性尽量保持接近源材料，从而减少污染的风险。冷冻过程需使用冷冻保护剂（如DMSO），并以理想的每分钟1°C的速度控制温度下降，防止细胞内冰晶形成，从而维护细胞活力。

实验步骤

1. 使用显微镜检查细胞的整体状态，确认无微生物污染，同时确保细胞处于对数增长阶段，活力一般需大于90%。
2. 按照标准传代方法收集并计数细胞。悬浮细胞以每毫升2-5×10⁶的细胞密度进行冷冻，贴壁细胞则以每毫升1-2×10⁶的密度进行冷冻。
3. 选择适当的冷冻保护剂，并计算所需的冷冻液体积，按配方配置冷冻液。
4. 将冷冻液中添加DMSO时，务必提前配置以避免其在添加时释放热量。
5. 离心细胞悬液，并将细胞沉淀重悬于PBS中，再进行离心。
6. 重悬细胞沉淀至配置好的冷冻液，充分混匀后转移至冻存管，并记录关键信息。
7. 将冻存管放入冻存盒中于-80°C下冰冻一夜，以控制温度的下降。
8. 将冻存管转移至液氮罐长期保存。

第二阶段 细胞复苏

细胞在需要使用时需尽快解冻，以减少对细胞活力的损害。通过离心去除冷冻保护剂的培养基是推荐的方法。

实验步骤

1. 将冷冻管放入37°C水浴中，轻轻摇动以加速解冻，适时取出。
2. 将细胞转移至预热的培养基中，进行离心。
3. 去除上清液后，重悬细胞，并选择适当的接种密度。
4. 根据细胞需求，添加所需的生长因子等成分。

第三阶段 观察

定期用显微镜和肉眼观察细胞，确认是否有微生物污染，并评估细胞的健康状态。

实验步骤

1. 目视检查细胞培养的状态，确保无污染，贴壁细胞的培养基应清澈。
2. 使用光学显微镜观察细胞生长及污染情况，包括细胞贴壁状态、细胞形态、融合度及细胞密度。

在整个过程中，需定期检查是否有支原体、细菌、真菌及酵母污染的迹象。不同细胞系也可能带来额外的污染风险。

第四阶段 细胞维持和传代培养

当细胞达到预期的生长状态时，应进行传代培养。若细胞尚未达到汇合度，需定期更换培养基，以防止毒性物质的积聚。

实验步骤

1. 在悬浮细胞的情况下，通过离心法清洗，并重悬于PBS中；贴壁细胞则需用PBS清洗。
2. 选择合适的传代稀释比例，将细胞接种至新培养容器，添加足量的生长培养基。
3. 在培养容器上标注细胞类型、传代次数及日期等信息，并进行孵育。
4. 持续监测细胞生长及污染迹象。

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