实验原理：平头连接是一种常用的DNA拼接技术，将事先制备好的平头载体与经过补平或削平处理的PCR产物直接连接。载体通常使用EcoRV或SmaI酶切制成平头；经过纯化的PCR产品，可以在22℃时使用DNA聚合酶I处理30分钟，以发挥该酶的3’→5’外切酶活性与5’→3’的聚合酶活性。对于连接要求不高的实验，也可以不对PCR产物进行额外处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶具备5’→3’的校对能力，最终扩增的PCR产物通常是平头的，因此无需再处理。

平端连接的明显缺点是连接效率较低。即使使用高活性的连接酶，或在反应体系中添加PEG8000，也难以显著提高连接效率。通常情况下，PCR产物可以直接与平端载体DNA连接，但连接效率往往较低。因为Taq DNA聚合酶具有非模板依赖的末端转移酶活性，会在两条DNA链的3'末端添加多余的碱基，使得合成的PCR产物成为具有3'突出碱基的DNA，这种结构导致连接效率低下。然而，通过使用大量的T4 DNA连接酶结合5-10 uT4 RNA连接酶，可以显著提高连接效率。对于较短的PCR产物，利用PUS19中的HincⅡ位点进行克隆，并应用X-gal和IPTG进行筛选，通常能够获得足够的重组子。

为了提高克隆效率，另一种方法是使用Klenow大片段或T4 DNA聚合酶去除3'末端的突出碱基，将PCR产物转化为平端DNA，然后再用平端连接法进行克隆。

实验步骤：

一、PCR反应

1. 依次混匀以下试剂： (1) H2O：35μl (2) 10×PCR反应缓冲液：5μl (3) 25 mmol/L MgCl2：4μl (4) 4种dNTP：4μl (5) 上游引物（引物1）：0.5μl (6) 下游引物（引物2）：0.5μl (7) 模板DNA（约1ng）：0.5μl 然后混匀并离心5秒。

2. 将混合物在94℃下加热5分钟后迅速冷却，离心数秒，使液滴沉至管底。加入Taq DNA聚合酶（0.5μl，约25U），混匀后稍作离心，最后加入一滴矿物油覆盖反应混合物。

3. 在94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，循环35轮进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下保温10分钟，以确保反应产物充分扩增。

二、电泳分析

取10μl扩增产物，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，以检查反应产物的质量与长度。

三、PCR产物的纯化

利用EVO视讯的产品进行PCR产物的纯化，提取有效的DNA以便后续实验。通过标准的酚/氯仿法或使用Wizard PCR DNA纯化系统，快速提取并浓缩PCR扩增液中的DNA，纯化后的DNA可直接用于测序、标记和克隆等实验。

四、载体加dT尾

1. 将1μg pUC19质粒用SmaⅠ全酶切。 2. 在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，将4μl 4种dNTP改为4μl 25mM dTTP。 3. 加入1μl (5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2小时。 4. 按照前文所述，用酚/氯仿提取两次。 5. 加入两倍体积的95％乙醇，在-20℃下沉淀1小时。 6. 离心后，用70％乙醇漂洗沉淀，真空抽干后溶于10ml ddH2O中。

五、PCR产物与载体粘末端连接

1. 在7ml PCR产物中加入1ml带dT尾的pUC质粒。 2. 加入1ml T4 DNA连接酶及1ml 10×连接缓冲液，混匀后在16℃下连接过夜。 3. 取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接

1. 在50ml的PCR产物中直接加入0.5ml T4 DNA聚合酶并混匀。 2. 在37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。 3. 使用酚/氯仿抽提两次，进行乙醇沉淀。 4. 使用70%乙醇漂洗沉淀后，真空抽干并溶于7ml ddH2O中。 5. 质粒用SmaI切开后，在70℃下灭活酶15分钟，再取1ml（约0.1mg）加入上述PCR产物中，加入T4 DNA连接酶1ml与连接缓冲液1ml。 6. 取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

注意事项：

1. PCR反应液可直接用于连接，但推荐进行PCR产物纯化，以去除dNTP及ATP，进而浓缩PCR产物。 2. PCR操作过程非常敏感，应在无菌操作台中进行。 3. 所用移液吸头和离心管需高压灭菌，使用后更换以避免交叉污染。 4. 加试剂前短暂离心10秒再打开管盖，以免手套污染试剂。 5. 应设置仅含模板DNA以外成分的负对照。 6. 纯化树脂在使用前应充分混匀。 7. PCR产物中的矿物油应尽量去除，以不影响DNA提取的效率。